注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
2-溴丁酸(>98%,BR)Sara (D5X4F) Rabbit mAb5-溴-2--甲氧基嘧啶

2-溴代萘Basigin/EMMPRIN (E1S1V) Rabbit mAbL-酸

2-溴酸(>99%,BR)SignalSilence® IRF-7 siRNA II1-環(huán)基-1,丁二酮

5-硝基-2-甲(>98%,BR)SignalSilence® PKCα siRNA IBOC-D-2,二氨酸

2-酰(>98.5%,BR)ACAT2 (E1L8V) Rabbit mAb(甲氧基)肼鹽酸鹽

2-(>98%,BR)Pan-AD (D3F7L) Rabbit mAb2,二肼鹽酸鹽

2-基磺酸鈉(>98%,BR)Mitochondrial Membrane Pontial Assay Kit (II)-5-氟甲

2'-脫氧肌酐-5'-酸鈉(>98%,BR)Phospho-Mcl-1 (Ser64) Antibody二溴新戊二

鄰氧基甲(>98%,BR)Semaphorin 3B (D5A2P) Rabbit mAb2,二氟丁

鄰氧基甲酸(>98%,BR)CNOT3 (E1L9S) Rabbit mAb(三氟甲基)異煙酸

2-基丁酸(>99%,BR)SAV1 (D6M6X) Rabbit mAb1-基-N-(基二甲硅基)-1,1-二甲基硅

鄰羥基酮(>99%,BR)SAV1 (D6M6X) Rabbit mAb吖啶酮酸

2-羥基(>98%,BR)SignalSilence®Mitofusin-1 siRNA II2,5-二溴-6-甲基吡啶

2-異基咪唑(>98%,BR)HIRA (D2A5E) Rabbit mAb非諾洛芬鈣二水合物

2-萘酸(植物激素級(jí))Cox2 (D5H5) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)2-溴-基噻唑

2-萘甲(>98%,BR)Phospho-BCL9L (Ser915) Antibody-氟甲

酸-2-萘酯(>98%,BR)DMAP1 Antibody6-硝基吲哚啉

2-基-beta-D-木糖苷(>98%,BR)Phospho-SHP-2 (Tyr580) (D66F10) Rabbit mAb (PE Conjuga)羥基-2-酮

果糖二酸縮酶A(ALDOA)ELISA試劑盒GATA-6  GATA結(jié)合蛋白6100 ul

果糖(FRA)ELISA試劑盒Gax  生長(zhǎng)終止特異性同源盒基因500 ul

廣州管園線蟲(chóng)(IgM)ELISA試劑盒GCN2  蛋白激酶GCN2蛋白100 ul

廣州管園線蟲(chóng)(IgG)ELISA試劑盒Phospho-GCN2 (Thr898)  酸化蛋白激酶GCN2蛋白100 ul

廣譜細(xì)胞角蛋白(P-CK)ELISA試劑盒phospho-GCN2 (Thr667)  酸化蛋白激酶GCN2蛋白100 ul

胱抑素SN(CST1)ELISA試劑盒GCP-2  粒細(xì)胞趨化蛋白2100 ul

胱抑素F(CST7)ELISA試劑盒CXCL7/NAP-2/PPBP  中性粒細(xì)胞趨化蛋白2100 ul

胱抑素B(CSTB/CST6/STFB)ELISA試劑盒CXCL9  γ干擾素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子100 ul

胱抑素A(CSTA/STF1/STFA)ELISA試劑盒CXCL11  干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子100 ul
牛瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格細(xì)胞骨架連接質(zhì)膜蛋白抗體2-(Phenylmethoxy)-naphthalene中文名：2-萘酚芐基醚別名：分子式：C17H14O

內(nèi)皮單核細(xì)胞激活肽2抗體2,2'-Biphel中文名：2,2'-聯(lián)苯酚別名：分子式：C12H10O2

轉(zhuǎn)錄因子E2F8抗體1-Benzyl-5-ethoxyhydantoin中文名：1-芐基-5-乙氧基海因別名：分子式：C12H14N2O3

遺傳性前列腺癌蛋白2抗體2-Benzylamipyridine中文名：2-苯甲基氨基吡啶別名：分子式：C12H12N2

真核翻譯起始因子5抗體5-Benzyl-1H-tetrazole中文名：5-芐基-1H-四唑別名：分子式：C8H8N4O
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。